Дегтярева С.И., Бадрак С.М., Панина В.А., Ионов С.Н.
ОЦЕНКА МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ МИКОБАКТЕРИИ ТУБЕРКУЛЕЗА *
Аннотация:
в данной работе представлена сравнительная характеристика лабораторных методов туберкулеза. Выполнены следующие задачи: изучение лабораторных методов диагностики микобактерий туберкулеза, оценка их чувствительности и экспрессивности
Ключевые слова:
туберкулез, микобактерии, сравнительная характеристика, диагностика, чувствительность, экспрессивность
УДК 616-093
Дегтярева С.И.
студентка 6 курса Реабилитация, Врач и Здоровье
Медицинский университет «Реавиз»
(Россия, г. Москва)
Бадрак С.М.
студентка 6 курса Реабилитация, Врач и Здоровье
Медицинский университет «Реавиз»
(Россия, г. Москва)
Панина В.А.
студентка 6 курса Реабилитация, Врач и Здоровье
Медицинский университет «Реавиз»
(Россия, г. Москва)
Научный руководитель:
Ионов С.Н.
д.б.н., к.м.н., преподаватель анатомии, патологии, микробиологии
Реабилитация, Врач и Здоровье»
Медицинский университет «Реавиз»
(Россия, г. Москва)
ОЦЕНКА МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ
МИКОБАКТЕРИИ ТУБЕРКУЛЕЗА
Аннотация: в данной работе представлена сравнительная характеристика лабораторных методов туберкулеза. Выполнены следующие задачи: изучение лабораторных методов диагностики микобактерий туберкулеза, оценка их чувствительности и экспрессивности.
Ключевые слова: туберкулез, микобактерии, сравнительная характеристика, диагностика, чувствительность, экспрессивность.
Введение
Россия входит в число 22 стран с самыми высокими показателями заболеваемости и смертности от туберкулеза. В последние годы численность впервые выявленных больных туберкулезом по сравнению с 90-ми годами увеличилась в 2 раза, в 1,5 раза смертность. Заболеваемость детей также увеличилась в 2 раза. Среди впервые выявленных больных туберкулезом увеличилась доля лиц с запущенными формами заболевания. В Московской области эпидемиологическая ситуация по туберкулезу остается напряженной. В 2011г. отмечали большие колебания показателя первичной заболеваемости по отдельным муниципальным образованиям от 37,2 случаев на 100 тыс. населения в Одинцовском районе до 129,3 на 100 тыс. населения в г. Орехово-Зуево. Рост первичной заболеваемости туберкулезом в последние годы в Подмосковье отмечен и у детей. Так в 2012г. на 100 тыс. населения он составил 0,15, то в 2013г. - 0,55.
Цель настоящей работы заключалась в сравнительной характеристике лабораторных методов диагностики туберкулеза.
Для этого необходимо решить следующие задачи:
- изучить лабораторные методы диагностики микобактерий туберкулеза;
- оценить их чувствительность и экспрессность.
В лабораторную диагностику на современном этапе входят следующие методики:
1) сбор и обработка мокроты;
2) микроскопическая идентификация микобактерий туберкулеза (МБТ) в выделяемых субстанциях или тканях;
3) культивирование;
4) определение резистентности к препаратам;
5) серологические исследования;
6) использование новых молекулярно-биологических методов, включая полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и определение полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ).
Бактериологический метод, окраска по Цилю-Нильсену
Доступным и простым методом выявления микобактерий туберкулеза из выделений больных считается микроскопия мазка, окрашенного по Цилю-Нильсену. Метод основан на окрашивании препарата карболовым фуксином:
-обработкой мазка 25% раствором серной кислоты, что приводит к обесцвечиванию некислотоустойчивых микобактерий;
-окрашивание мазка 0,3% раствором метилового спирта. Кислотоустойчивые микобактерии окрашиваются в малиново-красный цвет, а другие – в голубой.
Чувствительность метода составляет 100000 – 1000000 КОЕ*мл-1 исследуемого материала. Такое количество микобактерий встречается у больных с диссеминированными и фибринозно - кавернозными формами туберкулеза. У значительно большего числа больных количество выделяемых микобактерий значительно ниже разрешающей способности метода.
Люминесцентная микроскопия
Чувствительность метода люминесцентной микроскопии значительно выше от 10000 до 100000 КОЕ*мл-1 биологического материала. Метод основан на окраске мазка флюорохромами: ауромином и родамином.
При люминесцентной микроскопии определяются микобактерии в виде оранжевого или ярко- красного свечения на темном или зеленом свете.
Обогащение материала путем обработки иммуномагнитным сорбентом, который концентрирует возбудитель в осадке мокроты, позволяет повысить эффективность метода. Она увеличивается также при передаче изображения на компьютер при помощи вмонтированной в микроскоп видеокамеры.
Культуральный метод
Выявления микобактерий туберкулеза высокочувствителен и дает результаты при концентрации 20-100 жизнеспособных микробных клеток в 1 мл. Но в связи с трудоемкостью и длительностью исследования (2-2,5 месяца) он не устраивает клиницистов. Посев осуществляют на твердые среды: яично-картофельную Левенштайна-Йенсена, Фин-2 и В.А.Аникина. Эти среды богаты питательными веществами, что способствует быстрому росту облигатных анаэробов, которые не позволяют выделить медленно растущие микобактерии. Поэтому перед посевом биологических жидкостей проводят пробоподготовку: разжижение и деконтаминацию NaOH, выпускаемыми в наборах. Это еще больше снижает концентрацию микобактерий, что влияет на чувствительность метода. Значительные трудности представляет обнаружение микробактерий у лиц со скудным их выделением. Это при том, что среди впервые выделенных больных у одной трети бактериовыделение бывает однократным.
среда Левенштайна-Йенсена
Принцип ПЦР
Заключается в амплификации определенных участков ДНК при циклическом повторении трех стадий:
Специфичность гибридизации и достройки цепи обусловлена принципом комплементарности следующих пар азотистых оснований: А-Т, Г-Ц.
Обнаружение ДНК микробактерий методом ПЦР при эффективной химиотерапии определяется в течение более длительного времени – в среднем на 1,7 месяца по сравнению с бактериовыделением, определенным при люминисцентной микроскопии и на 2,5 месяца по сравнению с бактериологическим исследованием.
Секвенирование нового поколения (Nextgeneration sequencing, NGS) – массовопараллельное (глубокое) секвенирование фрагментов ДНК, исследование миллионов фрагментов ДНК/РНК за запуск. Биоинформатический анализ используется для объединения этих фрагментов путем сопоставления отдельных данных с эталонным геномом.
Целевое (таргетное) секвенирование на платформе NGS - позволяет определить нуклеотидные последовательности в отдельных участках генома (нескольких генах). Целевое NGS ориентировано на секвенирование выбранного набора генов или областей генов, с которыми ассоциированы специфические патогены.
Преимущества и перспективы:
Выявление LAM-антигена микобактерий
Липоарабиноманнан (LAM) является одним из основных структурных компонентов клеточной стенки микобактерий и представляет собой смесь высокомолекулярных липополисахаридов.
Наиболее информативным является исследование мочи, в которой LAM-антиген может быть обнаружен при различной локализации туберкулезного поражения в период гематогенной диссеминации процесса. Специфичность выявления LAM-антигена в моче методом LAM-ELISA составляет 95–100%. Чувствительность увеличивается по мере прогрессирования иммунодефицита у больных ВИЧ-инфекцией.
Тест для выявления LAM-антигена в моче наиболее целесообразно проводить при подозрении на туберкулез больным ВИЧ-инфекцией с количеством CD4+-лимфоцитов <200 клеток/мкл.
В настоящее время принцип определения LAM-Антигена реализован в коммерческих тест-системах только зарубежного производства. Тест LAM-пока не зарегистрирован для использования на территории Российской Федерации.
Косвенный иммунологический метод
IGRA-тесты (квантиферон)
Interferon – Интерферона
Gamma – Гамма
Release – Высвобождение
Assays – Анализ
Суть диагностических тестов in vitro (исследование крови) - при контакте специфических белков Mycobacterium tuberculosis (ESAT-6 и CFP-10) с Т-лимфоцитами крови инфицированного пациента выделяется гаммаинтерферон (IGRA). ESAT-6 и CFP-10 отсутствуют во всех штаммах бцж и большинстве нетуберкулезных микобактерий.
|
метод |
чувствительность, концентрация |
длительность выделения мбт |
эффективность метода в % |
дороговизна |
|
бак метод, окраса по Цилю-Нильсену |
100т-1млн |
2 недели |
33 |
низкая стоимость |
|
Люминисцентной мироскопии |
10т-100т |
2-3 недели |
45 |
высокая стоимость |
|
бак посев на среду Левенштайна-Йенсена |
20-200 кл |
4-8 недель |
49 |
|
|
ПЦР |
1-10 кл |
3 месяца |
74,5 |
|
|
Выявление LAM-антигена |
<200 клеток/мкл |
*** |
95 |
коммерческий, за рубежом |
|
IGRA-тесты (Квантиферон) |
*** |
24 часа |
100 |
на платной основе |
|
NGS |
? |
? |
? |
? |
Заключение
Исходя из приведенных данных лучшим способом на данный момент является ПЦР тесты, так как дают наибольшую чувствительность, и нужно малое количество клеток для исследования. Ведутся разработки для соотношения наилучшей среды, скорости выращивания бактерий, и денежных затрат.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
Федеральные клинические рекомендации по диагностике и лечению туберкулеза органов дыхания- — ООО «НЬЮ ТЕРРА», 2016- 52 С-. Издание второе
Яблонский П.К. - Фтизиатрия. Национальные клинические рекомендации.
Перельман М.И. - Фтизиатрия 2004
Гусейнов Г.К. – Фтизиатрия
Мишин. В. Ю. - Фтизиатрия
Degtyareva S.I.
6th year student "Reaviz" Rehabilitation, Doctor and Health
Reaviz University
(Russia, Moscow)
Badrak S.M.
6th year student "Reaviz" Rehabilitation, Doctor and Health
Reaviz University
(Russia, Moscow)
Panina V.A.
6th year student "Reaviz" Rehabilitation, Doctor and Health
Reaviz University
(Russia, Moscow)
Scientific advisor:
Ionov S.N.
Doctor of Biological Sciences
Candidate of Medical Sciences, lecturer of anatomy, pathology, microbiology
Rehabilitation, Doctor and Health
Reaviz University
(Russia, Moscow)
EVALUATION OF DIAGNOSTIC METHODS
FOR MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
Abstract: this paper presents a comparative characteristic of laboratory methods of tuberculosis. The following tasks were performed: the study of laboratory methods for the diagnosis of Mycobacterium tuberculosis, assessment of their sensitivity and expressiveness.
Keywords: tuberculosis, mycobacteria, comparative characteristics, diagnostics, sensitivity, expressiveness.
Номер журнала Вестник науки №12 (45) том 1
Ссылка для цитирования:
Дегтярева С.И., Бадрак С.М., Панина В.А., Ионов С.Н. ОЦЕНКА МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ МИКОБАКТЕРИИ ТУБЕРКУЛЕЗА // Вестник науки №12 (45) том 1. С. 156 - 166. 2021 г. ISSN 2712-8849 // Электронный ресурс: https://www.вестник-науки.рф/article/4983 (дата обращения: 16.04.2024 г.)
Вестник науки СМИ ЭЛ № ФС 77 - 84401 © 2021. 16+