Чередниченко В.Р.
БАКТЕРИАЛЬНЫЙ СОСТАВ МИКРОБИОМА КИШЕЧНИКА МЫШЕЙ ЛИНИИ C57BL/6 *
Аннотация:
взаимодействие между хозяином и связанной с хозяином кишечной микробиотой вызывает растущий интерес в последнее десятилетие. Микробиом кишечника влияет на ряд важных процессов в организме хозяина, а изменение его бактериального состава может привести к развитию патологических состояний. Данная работа посвящена изучению процентного соотношения различных групп бактерий микробиома кишечника самцов и самок мышей линии C57BL/6. Исследованы бактерии следующих филумов: Firmicutes, Actinobacteria, Bacteroidetes, Deferribacteres, «Candidatus Saccharibacteria», Verrucomicrobia, Tenericutes, Proteobacteria, Betaproteobacteria, Epsilonproteobacteria, Delta- и Gammaproteobacteria. В результате было расчитано среднее значение содержания бактерий основных групп микробиома кишечника, а также различия в микробиомах самцов и самок
Ключевые слова:
микробиом кишечника, бактерии, микрофлора, таксономия
УДК 579.69
Чередниченко В.Р.
магистрант 1 курса обучения,
факультет «Медико-биологический»
Воронежский государственный университет
(Россия, г. Воронеж)
БАКТЕРИАЛЬНЫЙ СОСТАВ МИКРОБИОМА КИШЕЧНИКА МЫШЕЙ ЛИНИИ C57BL/6
Аннотация: взаимодействие между хозяином и связанной с хозяином кишечной микробиотой вызывает растущий интерес в последнее десятилетие. Микробиом кишечника влияет на ряд важных процессов в организме хозяина, а изменение его бактериального состава может привести к развитию патологических состояний. Данная работа посвящена изучению процентного соотношения различных групп бактерий микробиома кишечника самцов и самок мышей линии C57BL/6. Исследованы бактерии следующих филумов: Firmicutes, Actinobacteria, Bacteroidetes, Deferribacteres, «Candidatus Saccharibacteria», Verrucomicrobia, Tenericutes, Proteobacteria, Betaproteobacteria, Epsilonproteobacteria, Delta- и Gammaproteobacteria. В результате было расчитано среднее значение содержания бактерий основных групп микробиома кишечника, а также различия в микробиомах самцов и самок.
Ключевые слова: микробиом кишечника, бактерии, микрофлора, таксономия.
Микробиом кишечника — микроорганизмы, которые живут в желудочно-кишечном тракте в симбиозе с носителем.
Микробиом контролирует ряд важных процессов: от метаболических и иммунных до когнитивных. Отклонение его состава от нормы приводит к развитию разнообразных патологических состояний[1].
Взаимодействие хозяин-микрофлора играет жизненно важную роль в правильном развитии иммунной системы. Микрофлора оказывает влияние на филогенез иммунной системы, онтогенетические закономерности развития мукозального и общего иммунитета, а также на эффективность и адекватность противоинфекционного ответа. Микроорганизмы колонизируют кишечник новорожденного сразу после рождения. Все больше исследований сообщается о том, как ранний состав/развитие микробиоты кишечника может влиять на факторы риска, связанные с состоянием здоровья взрослых организмов[2]. Обменные процессы в организме могут влиять на качественный и количественный состав микробиома кишечника, так же , как и бактериальный состав влияет на организм. Таким образом, микробиом кишечника может служить своеобразным индикатором патологических состояний в организме.
Так же, при помощи различных веществ или диет мы можем влиять на состав бактерий микробиома, тем самым влиять на обменные процессы в организме[3].
Объектом исследования послужили лабораторные мыши, как самцы, так и самки (Mus musculus) линии C57BL/6. Они были получены из Питомник Столбовая (Научный центр биомедицинских технологий, Россия) и размещены в пластиковых клетках в стандартных условиях (25 ºC, 12- часовой свет / темный цикл, относительная влажность, > 40 %) с доступом к пище и воде. С лабораторных мышей был собран кал, содержащий микробиом желудочно-кишечного тракта животных. После сбора фекальные остатки хранили при – 80 ºC до выделения ДНК.
Выделение ДНК из фекальных образцов проводилось при помощи комплекта реагентов ПРОБА-ГС от ДНК ТЕХНОЛОГИЯ.
После выделения ДНК был проведен горизонтальный электрофорез в 2 % агарозном геле для визуализации полученного результата, а также для определения обнаружения длины продукта ДНК. Затем была проведена амплификация референсных участков ДНК. Амплификация гена 16S рРНК проводилась из общей фекальной ДНК с использованием 11 пар уникальных праймеров. Амплификация проводилась с помощью приборов «Bio-Rad CFX96TM». Условиями ПЦР были: одна начальная стадия- предварительное нагревание (3 мин при 94 °С), 35 циклов ( в каждом из них 3 стадии: денатурация (95 °С в течение 20 сек), отжиг праймеров (20 с при температуре 60 °С) и элонгация цепи (72 °С в течение 20 с)), а также инкубирование смеси (72 °С в течение 5 мин.). Смесь для ПЦР содержит 10Х Taq буфер 5мкл, 25 мМ Mg2+ 1 – 5мкл, 10 мМ dNTP 1мкл, 20 мкМ праймер прямой 1мкл, 20 мкМ праймер обратный 1мкл (праймеры синтезированы компанией Евроген, Россия), Taq-полимераза 2.5ед/мкл 0,5 мкл, матрица ДНК 1 мкл и доводили объем с помощью mQ H2O до 25 мкл.
Статистическую обработку проводили с использованием пакета программ Excel Microsoft Office 2018 (Microsoft, США). Для определения достоверности результатов применяли метод вариационной статистики. При математической обработке использовали статистический критерий Стьюдента.
Анализ данных производили с использованием формулы: X=(Eff.UCTu/Eff.SCTs)*100, где «X» представляет собой процент числа бактерий определенного типа, Eff.U – расчетная эффективность универсальных праймеров (2 = 100 % и 1 = 0 %), а Eff.S относится к эффективности таксоноспецифичных праймеров. CTu и CTs –это значение CT, зарегистрированные термоциклером.
Данные по процентному соотношению бактерий микробиома кишечника мышей, представленный в таблице 1:
Таблица 1 - Процентное содержание бактерий микробиома кишечника самцов и самок мышей линии C57BL/6
|
Самцы |
Группы бактерий |
|||||||||
|
№ |
Sac |
Defer |
Ver |
Ten |
Beta |
Epsilon |
Gamma |
Bac |
Firm |
Act |
|
1 |
0,90 |
0,10 |
0,12 |
0,00 |
0,82 |
0,28 |
0,07 |
86,74 |
10,59 |
0,38 |
|
2 |
1,44 |
0,04 |
0,18 |
0,02 |
1,26 |
0,56 |
0,02 |
91,38 |
4,95 |
0,14 |
|
3 |
2,42 |
0,44 |
0,18 |
0,00 |
0,78 |
1,09 |
0,25 |
76,57 |
18,12 |
0,15 |
|
4 |
0,83 |
0,22 |
0,03 |
0,00 |
0,87 |
0,77 |
0,39 |
77,75 |
18,97 |
0,16 |
|
5 |
1,11 |
0,19 |
0,10 |
0,00 |
0,44 |
0,55 |
0,22 |
82,94 |
14,35 |
0,10 |
|
6 |
0,47 |
0,13 |
0,06 |
0,00 |
0,28 |
1,36 |
0,17 |
81,27 |
16,21 |
0,05 |
|
7 |
1,40 |
0,49 |
0,31 |
0,00 |
0,49 |
0,33 |
0,25 |
45,53 |
50,54 |
0,65 |
|
8 |
0,51 |
0,19 |
2,93 |
0,04 |
0,59 |
12,72 |
0,16 |
65,75 |
16,84 |
0,26 |
|
9 |
0,36 |
0,15 |
0,59 |
0,00 |
0,72 |
0,33 |
0,26 |
73,24 |
23,84 |
0,50 |
|
10 |
0,12 |
0,14 |
0,21 |
0,01 |
1,56 |
0,20 |
0,18 |
85,81 |
11,62 |
0,15 |
|
11 |
0,02 |
0,02 |
0,08 |
0,00 |
0,06 |
0,05 |
0,01 |
98,38 |
0,85 |
0,53 |
|
12 |
0,19 |
0,28 |
0,16 |
0,00 |
0,13 |
0,55 |
0,99 |
82,87 |
14,62 |
0,22 |
|
13 |
0,28 |
0,00 |
0,03 |
0,00 |
0,33 |
0,06 |
0,10 |
86,52 |
9,27 |
3,42 |
|
14 |
0,28 |
0,52 |
3,31 |
0,37 |
0,38 |
2,77 |
1,27 |
73,49 |
17,27 |
0,35 |
|
15 |
0,45 |
0,08 |
1,07 |
0,00 |
0,19 |
0,20 |
0,43 |
83,47 |
13,55 |
0,54 |
|
16 |
0,52 |
0,08 |
4,90 |
0,26 |
0,19 |
0,66 |
0,33 |
79,98 |
12,75 |
0,33 |
|
17 |
0,30 |
0,55 |
1,29 |
0,00 |
0,62 |
1,01 |
0,24 |
87,37 |
8,43 |
0,18 |
|
18 |
0,24 |
0,01 |
0,01 |
0,00 |
0,40 |
0,07 |
0,17 |
90,67 |
8,28 |
0,15 |
|
19 |
0,60 |
0,03 |
0,08 |
0,00 |
0,74 |
0,12 |
0,06 |
92,58 |
5,58 |
0,22 |
|
20 |
0,25 |
0,02 |
4,53 |
0,00 |
1,29 |
0,45 |
0,11 |
87,66 |
5,50 |
0,20 |
|
ср.знач. |
0,63 |
0,18 |
1,01 |
0,04 |
0,61 |
1,21 |
0,28 |
81,50 |
14,11 |
0,43 |
|
Самки |
||||||||||
|
1 |
0,18 |
0,05 |
11,60 |
0,08 |
0,41 |
0,63 |
0,00 |
79,31 |
7,46 |
0,28 |
|
2 |
0,31 |
0,02 |
3,63 |
0,01 |
0,01 |
0,41 |
0,00 |
79,18 |
16,32 |
0,11 |
|
3 |
1,82 |
0,11 |
0,08 |
0,00 |
0,14 |
0,00 |
0,00 |
70,29 |
26,74 |
0,82 |
|
4 |
0,07 |
1,16 |
0,05 |
0,00 |
0,01 |
0,01 |
0,00 |
46,89 |
51,65 |
0,17 |
|
5 |
0,00 |
0,00 |
18,94 |
0,00 |
0,05 |
0,00 |
0,00 |
62,99 |
18,01 |
0,01 |
|
6 |
0,64 |
0,11 |
3,41 |
0,00 |
0,46 |
0,06 |
0,00 |
56,02 |
39,21 |
0,08 |
|
7 |
0,04 |
2,00 |
3,08 |
0,00 |
0,27 |
1,77 |
1,00 |
54,66 |
36,97 |
0,22 |
|
8 |
0,08 |
0,04 |
3,83 |
0,00 |
0,59 |
0,21 |
0,05 |
90,71 |
4,38 |
0,10 |
|
9 |
0,30 |
0,21 |
1,95 |
0,04 |
0,24 |
0,28 |
0,23 |
40,98 |
55,66 |
0,12 |
|
10 |
0,10 |
0,38 |
22,68 |
0,04 |
0,48 |
0,57 |
0,84 |
57,61 |
17,09 |
0,20 |
|
11 |
0,85 |
0,20 |
3,30 |
0,10 |
0,53 |
0,83 |
0,45 |
65,01 |
28,38 |
0,34 |
|
12 |
0,78 |
0,22 |
0,87 |
0,00 |
0,08 |
1,32 |
0,24 |
80,29 |
15,83 |
0,35 |
|
13 |
0,51 |
0,18 |
0,16 |
0,15 |
0,20 |
0,94 |
1,60 |
74,61 |
21,02 |
0,62 |
|
14 |
2,04 |
0,04 |
6,18 |
0,01 |
0,05 |
0,48 |
0,22 |
77,60 |
12,75 |
0,64 |
|
15 |
1,23 |
0,05 |
1,31 |
0,03 |
0,12 |
1,80 |
0,89 |
75,90 |
18,62 |
0,07 |
|
16 |
0,95 |
0,29 |
0,81 |
0,04 |
0,06 |
11,77 |
0,76 |
68,60 |
16,41 |
0,31 |
|
17 |
0,11 |
0,06 |
0,82 |
0,00 |
0,17 |
0,30 |
0,12 |
92,38 |
5,88 |
0,16 |
|
18 |
0,11 |
0,06 |
0,55 |
0,01 |
0,32 |
0,09 |
0,05 |
90,44 |
8,19 |
0,18 |
|
19 |
1,07 |
0,01 |
2,83 |
0,00 |
0,07 |
0,12 |
0,08 |
91,34 |
4,28 |
0,20 |
|
20 |
0,18 |
0,03 |
3,02 |
0,01 |
0,52 |
0,09 |
0,03 |
91,99 |
3,93 |
0,20 |
|
ср.знач. |
0,57 |
0,26 |
4,45 |
0,03 |
0,24 |
1,08 |
0,33 |
72,34 |
20,44 |
0,26 |
Act – Actinobacteria, Bac – Bacteroidetes, Beta – Betaproteobacteria, Defer – Deferribacteres , Epsilon – Epsilonproteobacteria, Firm – Firmicutes, Gamma – Gammaproteobacteria , Sac – Candidatus Saccharibacteria, Ten – Tenericutes, Ver – Verrucomicrobia
Самое большое количество бактерий микробиома кишечника самцов мышей наблюдалось у филлумов Bacteroidetes 81,50±2,50%, Firmicutes 14,11±2,23% и Epsilonproteobacteria 1,21±0,62%.
Самое большое количество бактерий микробиома кишечника самцов мышей наблюдалось у филлумов Bacteroidetes 72,34±3,43% , Firmicutes 20,44±3,33% и Verrucomicrobia 4,45±1,41%.
Сравнив группу самцов и самок, выяснили, что у самцов процентное содержание бактерий филума Bacteroidetes больше на 9,16% (p=0,02), филума Verrucomicrobia меньше на 3,44% (p=0,01), филума Betaproteobacteria больше на 0,37% (p= 0,0004), чем у самок мышей линии C57BL/6.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
Резникова К.А., Чередниченко В.Р., Зубкова С.В., Попенкова А.В., Ляпина Д.В. Влияние бифидобактерий на состав микробиома кишечника мышей // Инновационные научные исследования. 2021. 7-1(9), С. 6–12.
Milani C, Duranti S, Bottacini F, Casey E, Turroni F, Mahony J, Belzer C, Delgado Palacio S, Arboleya Montes S, Mancabelli L, Lugli GA, Rodriguez JM, Bode L, de Vos W, Gueimonde M, Margolles A, van Sinderen D, Ventura M. The First Microbial Colonizers of the Human Gut: Composition, Activities, and Health Implications of the Infant Gut Microbiota // Microbiol Mol Biol Rev. 2017. Nov 8;81(4). e00036-17.
Оганезова И.А. , Медведева О.И. Изменения кишечной микробиоты как причина и потенциальная терапевтическая мишень при синдроме констипации // Медицинское обозрение. 2020. №5. С. 302-307
Yang YW, Chen MK, Yang BY, Huang XJ, Zhang XR, He LQ, Zhang J, Hua ZC. Use of 16S rRNA Gene-Targeted Group-Specific Primers for RealTime PCR Analysis of Predominant Bacteria in Mouse Feces // The State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology, College of Life Science. - 2015. - P. 6751.
Cherednichenko V.R.
student
1st year undergraduate, Faculty of Biomedical
Voronezh State University
(Russia, Voronezh)
BACTERIAL COMPOSITION OF THE INTESTINAL
MICROBIOME OF C57BL/6 MICE
Abstract: the interaction between host and host-related gut microbiota has generated growing interest in the past decade. The intestinal microbiome affects a number of important processes in the host's body, and a change in its bacterial composition can lead to the development of pathological conditions. This work is devoted to the study of the percentage ratio of different groups of bacteria in the intestinal microbiome of male and female C57BL / 6 mice. Bacteria of the following phyla were investigated: Firmicutes, Actinobacteria, Bacteroidetes, Deferribacteres, Candidatus Saccharibacteria, Verrucomicrobia, Tenericutes, Proteobacteria, Betaproteobacteria, Epsilonproteobacteria, Delta- and Gammaproteobacteria. As a result, the average value of the content of bacteria of the main groups of the intestinal microbiome was calculated, as well as the differences in the microbiomes of males and females.
Key words: gut microbiota, bacteria, microflora, taxonomy.
Номер журнала Вестник науки №2 (47) том 3
Ссылка для цитирования:
Чередниченко В.Р. БАКТЕРИАЛЬНЫЙ СОСТАВ МИКРОБИОМА КИШЕЧНИКА МЫШЕЙ ЛИНИИ C57BL/6 // Вестник науки №2 (47) том 3. С. 87 - 93. 2022 г. ISSN 2712-8849 // Электронный ресурс: https://www.вестник-науки.рф/article/5328 (дата обращения: 24.04.2024 г.)
Вестник науки СМИ ЭЛ № ФС 77 - 84401 © 2022. 16+